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文章譯自浙江大學(xué)蔡圣老師團(tuán)隊(duì)發(fā)表于Journal of Pharmaceutical Analysis（JPA）期刊的一篇綜述。原標(biāo)題為：《Recent advances and perspectives of nucleic acid detection for coronavirus》

新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）引起的肺炎暴發(fā)對(duì)全球公共衛(wèi)生構(gòu)成了巨大威脅。因此建立快速的標(biāo)準(zhǔn)診斷測試以檢測傳染病（COVID-19），防止繼發(fā)性傳播尤為重要。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）被視為具有高靈敏度和特異性的病毒和細(xì)菌感染分子診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。等溫核酸擴(kuò)增因?yàn)槠湓诤銣貤l件下無需熱循環(huán)儀即可快速操作的基本優(yōu)勢，被認(rèn)為是一種非常有前途的候選方法。這篇綜述總結(jié)了目前可用于冠狀病毒核酸的檢測方法，有助于研究人員和臨床醫(yī)生開發(fā)更好的技術(shù)，以及時(shí)有效地檢測冠狀病毒感染。

1 基于PCR的方法

PCR是一種酶學(xué)方法，可通過分離包含基因片段的兩條DNA鏈，用引物標(biāo)記其位置，并使用DNA聚合酶在每個(gè)片段旁邊組裝一個(gè)拷貝并連續(xù)復(fù)制這些拷貝來產(chǎn)生基因的多個(gè)拷貝，該技術(shù)被廣泛用于擴(kuò)增微量生物材料。由于它的高靈敏度和高序列特異性，基于PCR的方法已成為用于檢測冠狀病毒常規(guī)和可靠的技術(shù)。通常操作是，通過逆轉(zhuǎn)錄將冠狀病毒RNA轉(zhuǎn)移到cDNA中，然后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后通過特定的檢測方法或儀器檢測PCR產(chǎn)物。在這些中，凝膠可視化和測序是PCR技術(shù)之后用于檢測冠狀病毒方法，然而，由于其過程耗時(shí)且成本較高，這些方法在臨床樣品中并不常用。

實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）技術(shù)目前被冠狀病毒檢測所青睞，因?yàn)樗哂刑禺愋詮?qiáng)，簡便進(jìn)行定量分析的優(yōu)勢。此外，在早期，實(shí)時(shí)RT-PCR比常規(guī)RT-PCR測定法能夠診斷出更多感染者。因此，實(shí)時(shí)RT-PCR測定法仍然是一個(gè)主要的方法被應(yīng)用于檢測各種冠狀病毒的檢測。

盡管RT-PCR已經(jīng)在本次戰(zhàn)“疫”中大顯身手，但科學(xué)界依然投入大量精力來改進(jìn)實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)。因?yàn)镽T-PCR方法容易受到污染，并且樣品處理和PCR后數(shù)據(jù)分析耗時(shí)。因此，van Elden等描述了基于TaqMan的實(shí)時(shí)RT-PCR，可以在常規(guī)診斷設(shè)置中輕松實(shí)現(xiàn)HCoV的檢測。此外，為了進(jìn)一步提高靈敏度，Yip等人使用2個(gè)TaqMan探針代替1個(gè)探針設(shè)計(jì)了SARS-CoV的實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析。使用雙TaqMan探針進(jìn)行定量的這種簡單修飾方法在需要超敏性的領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，SARS-CoV檢測限為每個(gè)反應(yīng)1個(gè)拷貝RNA。

在臨床檢測中，缺乏安全和穩(wěn)定的外部陽性對(duì)照（EPC）可能成為冠狀病毒診斷中的嚴(yán)重問題，該問題已引起了廣泛關(guān)注。Yu等開發(fā)了一種實(shí)時(shí)RT-PCR分析，其中裝甲R(shí)NA被用作EPC來檢測SARS-CoV，檢測極限為10拷貝/μL。同時(shí)，冠狀病毒的快速突變性質(zhì)凸顯了對(duì)準(zhǔn)確檢測遺傳多樣性冠狀病毒的需求。因此，為了提高精確檢測冠狀病毒的能力并降低由基因組序列變異引起的假陰性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)，研究人員建立了多重實(shí)時(shí)RT-PCR方法，對(duì)冠狀病毒的多靶點(diǎn)檢測具有良好的敏感性。Hadjinicolaou等使用耐錯(cuò)配的分子信標(biāo)開發(fā)了實(shí)時(shí)RT-PCR測定法，以區(qū)分致病菌株和非致病菌株。該測定法包含四個(gè)信標(biāo)，除了內(nèi)部陽性對(duì)照外，還靶向四個(gè)基因。它已使用臨床樣品進(jìn)行了驗(yàn)證，該樣品具有目標(biāo)檢測能力和特異性，每個(gè)反應(yīng)的檢測極限為5個(gè)拷貝。

2 基于核酸等溫?cái)U(kuò)增的方法

2.1 基于常規(guī)的LAMP方法

LAMP是高效的新型等溫核酸擴(kuò)增方法。它通常用于DNA和RNA的擴(kuò)增，由于其指數(shù)擴(kuò)增特性，且分別由4種不同的引物同時(shí)鑒定的6個(gè)不同的靶序列而顯示出很高的靈敏度和高特異性。另一方面，LAMP技術(shù)測定快速且不需要昂貴的試劑或儀器，因此，LAMP檢測的應(yīng)用可能有助于降低檢測冠狀病毒的成本。目前，很多企業(yè)已經(jīng)開發(fā)了基于LAMP的冠狀病毒檢測方法并將其應(yīng)用于臨床診斷。

凝膠電泳通常用于分析擴(kuò)增產(chǎn)物以進(jìn)行終點(diǎn)檢測。潘等人報(bào)告了一種用于SARS診斷的簡單LAMP檢測方法，并證明了使用該技術(shù)檢測SARS-CoV的可行性。選擇SARS-CoV的ORF1b區(qū)域用于SARS診斷，并在6個(gè)引物的存在下通過LAMP反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，然后通過凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析。LAMP分析中SARS-CoV的檢測率和靈敏度與常規(guī)基于PCR的方法相似。Pyrc等成功地將LAMP用于瓊脂糖凝膠電泳檢測HCoV-NL63，在細(xì)胞培養(yǎng)物和臨床標(biāo)本中具有良好的靈敏度和特異性。值得注意的是，檢測極限是每個(gè)反應(yīng)1個(gè)RNA拷貝。可以檢測到焦磷酸鎂或熒光染料的沉淀。通過監(jiān)測焦磷酸鹽或熒光的濁度，可以使該方法實(shí)時(shí)進(jìn)行，從而有效地解決了終點(diǎn)檢測的局限性。

Shirato等人以這種方式開發(fā)了一種有用的RT-LAMP測定法，用于診斷和監(jiān)測人類MERS-CoV的流行病學(xué)。該技術(shù)能夠檢測到3.4份MERS-CoV RNA，并且具有高度特異性，與其他呼吸道病毒無交叉反應(yīng)。Thai等開發(fā)了一種單步單管加速實(shí)時(shí)定量RT-LAMP測定法，該測定法通過在光度計(jì)中實(shí)時(shí)測量濁度進(jìn)行監(jiān)控，以早期和快速診斷SARS-CoV。在臨床樣品中，發(fā)現(xiàn)該檢測方法的靈敏度比常規(guī)RT-PCR高100倍，檢出限為0.01個(gè)噬菌斑形成單位（PFU）。

2.2 基于特定序列的LAMP方法

然而，如果這些方法依賴于非特異性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方案，例如熒光染料插入任何雙鏈DNA擴(kuò)增子中，或者由于聚合過程中焦磷酸鹽的釋放而導(dǎo)致溶液渾濁，則不能排除由引物二聚體或非引物反應(yīng)產(chǎn)生的意外信號(hào)的可能性。一種用于監(jiān)視LAMP和其他等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的序列特定且可靠的方法，可以輕松地將真實(shí)信號(hào)與非特異性噪聲區(qū)分開來，解決此問題。

Shirato等通過使用淬滅探針（QProbe）監(jiān)測信號(hào)改進(jìn)了RT-LAMP測定，在檢測MERS-CoV方面與標(biāo)準(zhǔn)實(shí)時(shí)RT-PCR測定具有相同的性能。此外，黃等建立了一種將RT-LAMP和垂直流可視化條帶（RT-LAMP-VF）結(jié)合使用檢測MERS-CoV的核酸可視化技術(shù)。如圖1A 所示，等溫?cái)U(kuò)增中涉及的兩個(gè)環(huán)引物（LF和LB）分別用異硫氰酸熒光素（FITC）和生物素標(biāo)記。擴(kuò)增后，用生物素標(biāo)記的擴(kuò)增子可以結(jié)合與鏈霉親和素綴合的膠體金顆粒，形成復(fù)合物，隨后被包被在條帶文本行上的抗FITC抗體捕獲（圖1 B），從而呈現(xiàn)出肉眼可見的彩色線。在這種情況下，MERS-CoV RNA的檢出限為10拷貝/μL。

圖1. RT-LAMP-VF分析的示意圖。（A）用于RT-LAMP的擴(kuò)增反應(yīng)和（B）在可視化條上檢測。

埃靈頓小組的科學(xué)家做了很多工作，既可以提高LAMP檢測的特異性，又可以使讀數(shù)更簡單、更可靠。他們用稱為單步鏈置換（OSD）的介導(dǎo)鏈交換反應(yīng)代替了通常用于實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測的嵌入染料，并將其用于LAMP擴(kuò)增子的實(shí)時(shí)序列特異性驗(yàn)證。所得檢測結(jié)果可在30-50分鐘內(nèi)檢測出感染細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的0.02-0.2 PFU（5-50 PFU / mL）的MERS-CoV，并且不會(huì)與常見的人類呼吸道病原體發(fā)生交叉反應(yīng)還開發(fā)了其他鏈交換信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，以使LAMP反應(yīng)易于使用。如圖2所示，Du等通過將LAMP與熱穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化酶結(jié)合，可以直接將MERS冠狀病毒模板轉(zhuǎn)導(dǎo)為葡萄糖信號(hào)，通過商業(yè)血糖儀輕松讀取信號(hào)，可檢測20–100拷貝/μL。人絨毛膜促性腺激素（hCG）也被用作信號(hào)進(jìn)行分析。hCG與DNA寡核苷酸位點(diǎn)特異性結(jié)合，從而在基于LAMP的病毒測定中允許通過鏈交換將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到hCG的捕獲（信號(hào)關(guān)閉）和釋放（信號(hào)打開）中。當(dāng)人血清和唾液中僅有20拷貝病毒模板時(shí)，通過該方法也能準(zhǔn)確檢測到。

圖2 使等溫?cái)U(kuò)增適應(yīng)血糖儀的方案。 

同時(shí)，LAMP在65°C左右顯示最佳性能，這限制了其應(yīng)用。蔡等開發(fā)了一種LAMP版本，該版本使用了硫代磷酸酯化引物（PS-LAMP），能夠在生長輔酶的末端更有效地形成和延伸發(fā)夾，從而在較低的溫度下工作。研究表明，在40°C下用PS-LAMP檢測擴(kuò)增子的靈敏度和選擇性與65°C下的常規(guī)LAMP反應(yīng)相當(dāng)。

2.3  基于滾環(huán)擴(kuò)增放大的方法

滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）在核酸檢測中已經(jīng)獲得了相當(dāng)大的關(guān)注。在等溫條件下，RCA能夠在90分鐘內(nèi)將每個(gè)圓的信號(hào)放大10⁹倍。有學(xué)者在液相和固相中都建立了通過RCA檢測SARS-CoV的有效方法，并在少量臨床呼吸道標(biāo)本上提供了初步結(jié)果。RCA的主要優(yōu)點(diǎn)是，它可以在恒溫條件下用最少的試劑進(jìn)行操作，并且避免了假陽性結(jié)果的產(chǎn)生，而這在基于PCR的測定中經(jīng)常遇到。

3 基于微陣列的方法

微陣列法是一種快速且高通量的檢測方法。在這種方法中，冠狀病毒RNA將首先通過逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生用特定探針標(biāo)記的cDNA。然后將這些標(biāo)記的cDNA加載到每個(gè)孔中，并與固定在微陣列上的固相寡核苷酸雜交，然后進(jìn)行一系列洗滌步驟以去除游離DNA。最后，可以通過檢測特定探針來檢測冠狀病毒RNA。由于其快速、高通量的優(yōu)越性，微陣列分析已廣泛用于冠狀病毒的檢測。

Shi等根據(jù)TOR2的序列設(shè)計(jì)了一個(gè)60 mer的寡核苷酸微陣列，并將其成功地用于臨床樣品中SARS冠狀病毒的檢測。但是，考慮到SARS-CoV的快速突變，Guo等開發(fā)了一種微陣列，可在樣本檢測中以100％的準(zhǔn)確度檢測SARS-CoV的尖峰（S）基因中的24個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）突變。Luna等設(shè)計(jì)了一種無熒光的低成本，低密度寡核苷酸陣列，用于檢測整個(gè)冠狀病毒屬，其靈敏度與各個(gè)實(shí)時(shí)RT-PCR的靈敏度相同，Hardick等（2002）評(píng)估了一種基于微陣列芯片的新型，便攜式和近POC診斷平臺(tái)，即移動(dòng)分析平臺(tái)（MAP），它在識(shí)別病毒和可接受的檢測限方面具有良好的性能。

4 新開發(fā)的方法

相關(guān)酶的Cas13 RNA靶向CRISPR最近已適于核酸[快速和便攜式傳感。Zhang的研究小組證明，Cas13可以被編程為靶向并破壞多種哺乳動(dòng)物單鏈RNA病毒的基因組（圖3）。他們開發(fā)了一個(gè)名為SHERLOCK（特定的高靈敏度酶報(bào)告分子解鎖）的平臺(tái)，該平臺(tái)將等溫預(yù)擴(kuò)增與Cas13結(jié)合使用，以檢測RNA或DNA的單分子。它可以檢測登革熱或Zika病毒單鏈RNA以及患者液體活檢樣品中的突變。網(wǎng)站（https://broad.io/sherlockprotocol）上報(bào)道了他們最近關(guān)于COVID-19的協(xié)議，題為“使用CRISPR診斷程序檢測COVID-19的協(xié)議”，該協(xié)議可能為有興趣進(jìn)一步研究的研究人員提供一些參考點(diǎn)該診斷系統(tǒng)突出了其作為核酸的可復(fù)用，便攜式，快速和定量檢測平臺(tái)的潛力。

圖3 使用Cas13檢測RNA病毒的方案。

總結(jié)與展望

當(dāng)前，COVID-19的診斷主要依賴于冠狀病毒RNA的檢測。選擇適當(dāng)?shù)臋z測方法非常重要。但是，上述每種方法都有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)和不可避免的缺點(diǎn)。PCR以高靈敏度和特異性廣泛用于病毒鑒定，但其分析需要各種專業(yè)設(shè)備和受過專業(yè)培訓(xùn)的分析人員，而這只能由完善的實(shí)驗(yàn)室來完成。LAMP是一種超靈敏的核酸擴(kuò)增方法，通常可以在大約一個(gè)小時(shí)內(nèi)檢測少量的DNA或RNA模板，但是高溫的要求仍然限制了其適用性。至于微陣列，高成本不可避免地限制了它在冠狀病毒檢測中的進(jìn)一步應(yīng)用。

迄今為止，科學(xué)家們已經(jīng)做出了很大的努力來改善冠狀病毒的檢測，并且已經(jīng)開發(fā)了各種改進(jìn)的或新的方法。在實(shí)際應(yīng)用中，通常將幾種方法結(jié)合起來，以盡量避免使用單一方法的弊端。簡而言之，隨著新技術(shù)和方法的飛速發(fā)展，我們相信未來將開發(fā)出更加出色和高效的檢測方法，這將為科學(xué)家/臨床醫(yī)生提供更多選擇。同時(shí)，只有根據(jù)特定目的平衡各種檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)，才能獲得最經(jīng)濟(jì)，最優(yōu)化的選擇。

作者蔡圣：現(xiàn)任浙江大學(xué)藥學(xué)院副教授，碩士生導(dǎo)師。主要從事藥物分析新方法新技術(shù)研究，包括功能納米材料、核酸適配體技術(shù)在蛋白及藥物檢測中的應(yīng)用；核酸擴(kuò)增方法在藥物和藥物效應(yīng)分子檢測和成像中的應(yīng)用。

關(guān)于JPA：JPA于2011年創(chuàng)刊，是一本藥物分析研究領(lǐng)域的英文專業(yè)期刊，由教育部主管、西安交通大學(xué)主辦，與Elsevier合作出版，西安交通大學(xué)藥物分析研究所賀浪沖教授擔(dān)任主編。