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血清是細(xì)胞培養(yǎng)試劑中最普遍的試劑之一，之前我們已經(jīng)介紹過了有關(guān)血清的一些小知識（血清知識大盤點），那么今天我們將繼續(xù)了解有關(guān)血清沉淀與血清熱滅活的相關(guān)知識~

血清沉淀是否會影響細(xì)胞生長？如何避免？熱滅活血清如何處理？有必要對血清進行熱滅活嗎？
 

血清沉淀

1. 血清沉淀是什么？   

血清中經(jīng)常會出現(xiàn)肉眼可見的沉淀，其成分有多種類型，產(chǎn)生的原因有很多。主要有纖維蛋白（絮狀沉淀）、甲胎蛋白、脂蛋白、冷凝集素、玻粘連蛋白、磷酸鈣（顯微鏡下小黑點沉淀）、膽固醇等。

• 纖維蛋白（Fibrin）

  血清中肉眼可見的沉淀物大多屬于這一類型。由于在生產(chǎn)過程中，血清采集、過濾（3 次 0.1μm過濾）和灌裝處理都是在低溫條件下快速完成, 此時血清中纖維蛋白原（Fibrinogen）處于溶解狀態(tài)。但在解凍之后, 血清中纖維蛋白原往往會發(fā)生凝集，形成肉眼可見的沉淀。

  

▲ 纖維蛋白沉淀圖

• 磷酸鈣（Calcium Phosphate）

  這是一種常見的沉淀成分，通常會造成血清出現(xiàn)云霧狀渾濁。當(dāng)血清在 37℃保存時，這種現(xiàn)象尤其明顯，在倒置顯微鏡下可觀察到小黑點的存在。這些小黑點在布朗運動的作用下四處游動，常被誤認(rèn)為是微生物污染。

• 其他成分（Other）

  血清中的其他成分也會形成沉淀，例如膽固醇形成的油脂滴和其他蛋白沉淀等。

2. 沉淀是如何形成的？            

造成沉淀的主要原因是溫度的改變、熱滅活、反復(fù)凍融、長期儲存于2-8℃或者室溫。

3. 血清沉淀會影響細(xì)胞培養(yǎng)嗎？

我們在出廠前都會對血清進行一系列質(zhì)檢測試，確保血清質(zhì)量達到嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)。血清測試和細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗也表明，其沉淀成分不會影響血清作為細(xì)胞培養(yǎng)添加物的表現(xiàn)。這一點得到了眾多用戶和其他血清供應(yīng)商的肯定。解凍之后, 血清中纖維蛋白原往往會發(fā)生凝集，形成肉眼可見的沉淀。

磷酸鈣顆粒經(jīng)常會被當(dāng)成微生物污染而引發(fā)不必要的擔(dān)憂。一般情況下，當(dāng)操作人員融化血清后注意到有霧狀渾濁時，常將其存放在 4℃冰箱中觀察，并考慮接下來是否繼續(xù)使用。但這樣會使沉淀進一步增多，反而會使血清更加渾濁，進而誤以為存在血清污染。并且，在倒置顯微鏡下，可在血清中觀察到小黑點（磷酸鈣顆粒的布朗運動），更容易使人誤以為存在微生物污染。 

為防止這類誤解的產(chǎn)生，我們不建議用戶培養(yǎng)血清來驗證是否存在污染，而是將血清直接接種在細(xì)菌培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，以觀察是否有細(xì)菌的增殖。并且，進行革蘭氏染色，并在油鏡（100 X 10 倍）下觀察可直接確認(rèn)是否存在微生物污染。

VivaCell血清采用國際先進標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)過3次0.1μm過濾，有效去除霉菌、細(xì)菌、酵母菌、支原體等，并通過ISO13485質(zhì)量體系認(rèn)證。

4. 如何避免血清沉淀                

• 正確解凍

  首先，應(yīng)按照逐步解凍的方式正確解凍血清：從-20℃取出后，置于4℃冰箱緩慢解凍，最后置于室溫完成解凍。如果直接從-20℃拿到室溫或37℃水浴解凍，則非常容易產(chǎn)生沉淀。在解凍過程中，請注意，應(yīng)時不時緩慢搖晃血清瓶，可減少沉淀的產(chǎn)生。為避免反復(fù)凍融，建議您將血清分裝使用。 

• 使用和保存注意事項

  血清沉淀很難預(yù)測和避免，出現(xiàn)沉淀后也無需擔(dān)憂，這并不會影響血清的品質(zhì)。已知血清沉淀在以下條件下會有增多的可能：

  1) 熱滅活；

  2) 37℃培養(yǎng)；

  3) 反復(fù)凍融；

  4) 伽馬射線照射； 

  5) 2-8℃長期保存； 

  6) 長期保存于可自動化霜的冰箱中（溫度不穩(wěn)定）；

• 血清沉淀的形成機理多種多樣，具體的機理尚不十分明確。我們尚不能準(zhǔn)確預(yù)測和控制血清沉淀的產(chǎn)生。目前市面上所有品牌的血清產(chǎn)品都存在沉淀現(xiàn)象，這一點可以在各品牌官方網(wǎng)站上關(guān)于沉淀問題的聲明上得到證實。

5. 有沉淀時如何處理？             

我們建議您采用2000rpm離心5分鐘，取上清使用就好，比過濾方便，不需要另外準(zhǔn)備濾芯和針筒，且不容易污染。

★血清產(chǎn)品中出現(xiàn)沉淀屬于正?，F(xiàn)象，不會影響到血清的品質(zhì)，對細(xì)胞培養(yǎng)也不會產(chǎn)生影響，大家可以放心使用，若不立即使用，血清應(yīng)保存在-20℃以下。
 

1. 為何會有熱滅活血清呢？

加熱可以滅活補體系統(tǒng)。啟動的補體系統(tǒng)參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，啟動淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化。在免疫學(xué)研究中，培養(yǎng)ES細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時，推薦使用熱滅活血清。

2. 血清熱滅活是否必要？

血清熱滅活的步驟在1970年代就已建立，至今成為很多實驗室的常規(guī)血清前處理步驟；但許多先前認(rèn)為必須熱滅活的原因，卻早已經(jīng)不再成立：

• 去除支原體污染?
  早期血清加工使用的450nm濾膜，早已被100nm濾膜取代；且隨著加工技術(shù)的創(chuàng)新及嚴(yán)格的監(jiān)控，血清產(chǎn)品早已沒有支原體污染的疑慮。

• 去除補體等對熱敏感的物質(zhì)? 
  胎牛血清中含有的補體僅為成年牛血清5-50％，而C3（補體中引起免疫反應(yīng)的主成分）在胎牛血清中則幾乎不能檢出，直接使用血清對大多數(shù)的細(xì)胞株沒有負(fù)面影響。

實驗顯示，大多數(shù)的細(xì)胞不需要熱滅活血清，對于非必須的細(xì)胞來說血清滅活對于細(xì)胞生長只有微小甚至無任何作用，還可能造成生長速率降低，沉淀物還會顯著增多，不利于細(xì)胞觀察。因此，若非必須，不需要對血清進行滅活處理。

3. 血清熱滅活對細(xì)胞生長有幫助嗎？

細(xì)胞生物學(xué)家比較了正常熱滅活胎牛血清對各種細(xì)胞株的生長能力影響，發(fā)現(xiàn)11株細(xì)胞中，熱滅活對6 株細(xì)胞有負(fù)面影響（紅）、3株無影響（綠）、2株有微弱正面改善（黃）。

▲ 使用未滅活或滅活血清的細(xì)胞生長狀況

所以，在正常操作下，熱滅活通常對“細(xì)胞生長”沒有明顯的促進作用，反而會破壞血清內(nèi)生長因子，維生素，氨基酸等珍貴物質(zhì)，降低細(xì)胞增殖速度。

4. 血清熱滅活的缺點？

若實驗員設(shè)錯水浴溫度或忘記按計時器，都會導(dǎo)致過高的加熱溫度（下圖）或過長的加熱時間（下圖），進而大大降低血清的功能，影響細(xì)胞生長的表現(xiàn)。

缺點1：

▲ 過高的加熱溫度降低大多細(xì)胞株生長速度（僅一株未受明顯影響）

缺點2：

▲ 過長的加熱時間降低大多細(xì)胞株生長速度
（僅一株未受明顯影響）

滅活加熱過程會增加血清的沉淀狀況，而沉淀又常常被認(rèn)為是微生物的污染，進而耗費大量時間及精力驗證是否污染，導(dǎo)致實驗一再拖延。
 

5. 若細(xì)胞一定要使用熱滅活血清怎么辦？

將需要進行處理的血清置于56℃水浴30min，建議加放空白對照（同體積水）使用溫度計測溫，以測得溫度為56℃時為計時起始點，加熱中可不時輕度旋轉(zhuǎn)混勻血清。

在滅活過程中，除了需要嚴(yán)格監(jiān)測加熱溫度及認(rèn)真計算時間，還有幾個小技巧可以注意噢！

滅活時，水浴槽水面與血清液面等高！

使用水浴槽時，大多數(shù)人為避免血清瓶浮起來，會減少水浴槽內(nèi)的水量，讓水面降低；數(shù)據(jù)顯示，降低水面也會使瓶內(nèi)加熱不均、拉長加熱時間，增加血清破壞程度；所以還是建議將水浴槽內(nèi)水量增加，讓水面與血清液面等高，讓血清最大面積的接觸水流，提高滅活效率！

▲ 對比圖

至于血清瓶漂浮的問題，套上燒瓶用鉛環(huán)（下圖）就解決啦！

▲ 固定

滅活后，使用冷水浴降溫！　　

滅活后如果直接放在室溫或4度冰箱冷卻，僅靠空氣傳導(dǎo)散熱，冷卻效果差（下圖），使得實際降溫時間拉長，對血清的影響較大；反之，流動的冷水浴散熱速度較快，冷卻效果佳，縮短降溫時間的同時，也減少對血清的破壞。

▲ 對比圖

★現(xiàn)代血清加工技術(shù)進步，熱滅活已成為非必要步驟。熱滅活對細(xì)胞生長沒有明顯促進作用，反而會破壞血清、增加沉淀狀況。除非文獻指出該細(xì)胞必須使用滅活血清，一般細(xì)胞培養(yǎng)可省略血清熱滅活步驟。

如果必須使用滅活血清，加熱時水浴槽水面高度盡量與血清液面等高；滅活后使用冷水浴取代冰箱降溫，能最大程度減少對血清的破壞。直接選擇購買已滅活的血清產(chǎn)品，也是個好選擇噢！

 

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