smFISH成像采用最新高分辨寬場技術(shù)，揭示腸道神經(jīng)系統(tǒng)通過表達IL18參與粘膜免疫屏障
——研究成果發(fā)表于《Cell》
一支由耶魯大學YSM、哈佛醫(yī)學院BWH、蘇黎世大學IMCR和烏得勒支大學的科學家組成的國際團隊共同合作，發(fā)現(xiàn)腸神經(jīng)系統(tǒng)分泌的IL-18介導粘膜免疫屏障。2020年1月9日，國際學術(shù)期刊《Cell》在線發(fā)表了這一成果
[1]。在此篇文獻研究中，使用了THUNDER Imager 3D live cell高分辨寬場系統(tǒng)。
《Cell》是與《Science》、《Nature》齊名的重要國際性刊物。《Cell》也是
細胞生物學的最高期刊。2019最新的影響因子（Impact Factor）是 36.216。
腸道神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system， ENS）廣泛分布于腸道組織的每個角落，最新涌現(xiàn)的多個研究報道發(fā)現(xiàn)ENS可以調(diào)控腸道組織的免疫作用
[2]。但是ENS怎么參與粘膜免疫的呢，媒介是什么，作用機制又是怎樣的此前還未有研究成果。如今，以耶魯大學醫(yī)學院Richard A. Flavell和哈佛醫(yī)學院布萊根婦女醫(yī)院Roni Nowarski為首的這支國際團隊，研究并揭示了腸神經(jīng)系統(tǒng)(ENS)如何參與維持腸粘膜免疫屏障。在沙門氏菌等致病菌的侵襲過程中，宿主細菌在腸道內(nèi)的防御是由ENS介導的。此研究使用了THUNDER系統(tǒng)進行smFISH成像，統(tǒng)計了特定ENS細胞中的RNA單分子的數(shù)量，驗證了IL18廣泛在小鼠結(jié)腸組織ENS中有表達
[1]。
此表明，THUNDER 不僅僅提供清晰銳利的圖像，統(tǒng)計意義上的量化分析結(jié)果也獲得了國際權(quán)威期刊的認可。
文獻鏈接：https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(19)31378-9.
文章中單分子熒光原位mRNA雜交smFISH成像均是使用THUNDERImager 3D live cell系統(tǒng)完成的
文獻賞析：
Enteric Nervous System-Derived IL-18 Orchestrates Mucosal Barrier Immunity
（腸神經(jīng)系統(tǒng)分泌的IL-18參與粘膜免疫屏障）
文章簡介：
粘膜免疫屏障是維持共生菌群和抵抗侵襲性細菌感染的必要條件。雖然過去普遍認為協(xié)調(diào)維護這種腸道穩(wěn)態(tài)的是免疫細胞和上皮細胞，但在這篇新發(fā)表的文章中，作者證明腸神經(jīng)系統(tǒng)(ENS)在其中也扮演著重要的角色。ENS產(chǎn)生的促炎細胞因子IL-18能誘導腸上皮細胞產(chǎn)生抗菌蛋白（AMP），抵抗腸道感染。
通過共聚焦顯微鏡單細胞成像和THUNDER的smFISH組織成像的結(jié)合，作者觀察到腸神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生促炎細胞因子IL-18。值得注意的是，僅僅在腸神經(jīng)元中特異性敲除IL-18，可加劇小鼠的鼠傷寒沙門氏菌(S.t.)感染。說明源于腸神經(jīng)的IL-18對于抵抗腸道細菌感染是必須的；而特異性敲除免疫細胞或腸上皮細胞中的IL-18，不會影響小鼠對S.t.腸道感染的易感性。文章再結(jié)合單細胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)來探究ENS來源IL-18的功能以及作用方式。最終發(fā)現(xiàn)ENS特異性來源的IL-18能誘導結(jié)腸杯狀細胞增加表達抗菌蛋白AMP，從而抵抗致病菌的侵襲。說明腸神經(jīng)系統(tǒng)是抵御腸道致病菌的重要免疫介質(zhì)。
以下就是文中使用THUNDER Imager 3D live cell成像的smFISH圖像，驗證了腸神經(jīng)系統(tǒng)ENS中的確廣泛存在IL18的表達。
圖2E用smFISH檢測小鼠結(jié)腸組織中IL18 (紅色)、Tubb3(白色) 的表達；DAPI(藍色)表示細胞核。此圖可觀察到IL18 mRNA探針(紅色)與神經(jīng)元特異性Tubb3 mRNA探針(白色)的共定位。
實驗方法：處死小鼠，取出結(jié)腸，用冷PBS沖洗。結(jié)腸組織縱向切開，鋪于濾紙上。用4% 多聚甲醛PBS溶液固定3 h；隨后用30% sucrose, 4% PFA PBS溶液4度過夜孵育。切成7mm厚度切片，并使用smFISH染色。設(shè)計的FISH探針庫與Cy5 (IL18)、TMR (Tubb3)連接，smFISH探針集雜交(Moor et al.,2018)。封片前再去除ENS內(nèi)的自發(fā)熒光信號。smFISH成像是在Leica THUNDER 3D Live Cell系統(tǒng)上進行的，使用自帶的THUNDER Computational Clearing設(shè)置。
原文結(jié)論：在小鼠中使用Il18 mRNA探針進行單分子熒光原位mRNA雜交（smFISH）。作者使用來自Il18 -/-小鼠的結(jié)腸切片驗證了他們的Il18 mRNA探針的特異性。并觀察到Il18 mRNA探針和神經(jīng)元特異性Tubb3 mRNA探針有共定位（圖2E）。總之，這些數(shù)據(jù)表明腸神經(jīng)系統(tǒng)是結(jié)腸中IL-18的新型生產(chǎn)者。
圖S1B 在野生型或 Il18-/- 的小鼠結(jié)腸中，通過smFISH 成像使 Il18 mRNA (白色) 和 DAPI (藍色)可視化。數(shù)據(jù)顯示Il18-/- 的小鼠結(jié)腸中Il18 mRNA探針的信號丟失. 圖中刻度尺代表25um.
右邊樣圖顯示結(jié)腸傳入背根神經(jīng)節(jié)中指示
基因的表達和分布。
關(guān)于單分子熒光原位雜交(smFISH)技術(shù)：
全稱single-molecule fluorescence in situ mRNA hybridization (smFISH)，是研究單細胞
基因表達能力的一種新的強有力的技術(shù), 因為它能夠檢測和計數(shù)單個 RNA 分子。與深度測序方法互補, smFISH 提供了有關(guān)轉(zhuǎn)錄豐度的細胞間變異和特定 RNA 亞單位定位的信息。
[3][4]另外有smFISH相關(guān)文獻表示，為了收集smFISH探針發(fā)出的最大數(shù)量的光子，更建議使用寬場技術(shù)。共焦顯微鏡會顯著限制要收集的光的數(shù)量
[5]，而寬場技術(shù)會是對smFIGH成像更好的選擇。
當然，這篇發(fā)表在《CELL》的文獻內(nèi)也大量使用了共聚焦技術(shù)對大鼠結(jié)腸神經(jīng)元進行單個細胞的免疫熒光成像。
綜上所述，此文章很好地結(jié)合了共聚焦成像和高分辨寬場技術(shù)。采用THUNDER高分辨寬場技術(shù)對smFISH探針進行快速大面積結(jié)腸組織成像，在RNA角度檢測到IL18 與Tubb3 的共表達，驗證了有IL18在小鼠結(jié)腸組織ENS的普遍的總體表達；再結(jié)合了共聚焦技術(shù)對大及小鼠結(jié)腸組織分離的肌間神經(jīng)叢的高倍成像，在蛋白的角度觀察到IL-18和Tubb3共同表達在單個神經(jīng)元細胞內(nèi)。最后兩種方法互相印證，得出了腸道神經(jīng)系統(tǒng)ENS能產(chǎn)生抗炎細胞因子IL-18的結(jié)論。
這也是首次揭示了ENS能夠產(chǎn)生抗炎細胞因子IL-18，抵抗致病菌的侵襲，維持腸黏膜免疫屏障。
THUNDER高分辨率快速的特點很好地滿足了小鼠結(jié)腸組織切片smFISH快速大視野掃描。不僅僅提供清晰銳利的圖像，由于成像速度快，能對組織進行大面積高清掃描，故此能用于后期的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。文章以THUNDER的smFISH成像為基礎(chǔ)，特定統(tǒng)計了ENS細胞中的RNA單分子的數(shù)量，驗證了IL18廣泛在小鼠結(jié)腸組織ENS中有表達。
再加上此前的以下兩篇文章，THUNDER累計文章已達到三篇了。
2019-Molecular imaging of fibroblast activity after myocardial infarction using a 68Ga-labelled
2019年8月發(fā)表于《
Journal of Nuclear Medicine》，IF 7.354，使用THUNDER Imager 3D Tissue型號。
[6]
Left-right asymmetric heart jogging increases the robustness of dextral heart looping in zebrafish
2019年11月發(fā)表于
《Developmental Biology》，IF 2.936，使用THUNDER Model Organism型號。
[7]想掌握詳細THUNDER產(chǎn)品資料，請見：
徠卡推出創(chuàng)新性產(chǎn)品——THUNDER 寬場高清成像系統(tǒng)！徠卡THUNDER Imager 高速、高分辨率寬場顯微鏡應(yīng)用紀要參考文獻：
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