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自 2019 新型冠狀病毒（2019-nCoV）肺炎疫情爆發(fā)以來，相關(guān)科研單位便緊鑼密鼓地開展病毒研究工作，并取得了一系列重要的研究成果。2 月 3 日，Nature 在線發(fā)布了復(fù)旦大學(xué)張永振教授團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)重要研究成果，該團(tuán)隊(duì)對患者支氣管肺泡灌洗液進(jìn)行了宏基因組二代測序（mNGS），鑒定出了一種新型冠狀病毒，并發(fā)現(xiàn)該病毒基因組與蝙蝠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的 SARS 樣冠狀病毒基因組有 89.1% 的相似性^[1]。

張永振教授團(tuán)隊(duì)發(fā)表的文章截圖 | 圖源：Nature

2 月 20 日，bioRxiv  預(yù)印本平臺發(fā)布了華南農(nóng)業(yè)大學(xué)沈永義教授、肖立華教授團(tuán)隊(duì)關(guān)于新冠病毒中間宿主的研究成果。通過對穿山甲樣品進(jìn)行宏基因組分析，該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)穿山甲為新型冠狀病毒潛在中間宿主^[2]。

沈永義教授、肖立華教授團(tuán)隊(duì)發(fā)表的文章截圖 | 圖源：bioRxiv

可以說，宏基因組測序在新病原體的診斷、監(jiān)測、跟蹤，以及溯源方面具有關(guān)鍵作用，更是新冠病毒研究的一大助力。

宏基因組測序：病原體檢測的新風(fēng)口

1998 年，威斯康辛大學(xué)的 Jo Handelsman 提出宏基因組學(xué)（Metagenomics）的概念，并將其定義為：一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對象，以功能基因篩選和測序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系、以及與環(huán)境之間的關(guān)系為研究目的的新的微生物研究方法^[3]。

包括宏基因組學(xué)在內(nèi)的各類組學(xué)研究（右）相較傳統(tǒng)遺傳學(xué)與生物化學(xué)方法（左）在全基因水平的研究上效率更高 | 圖源：Science

2014 年，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志發(fā)表宏基因組二代測序（mNGS）確診鉤體病的首例臨床應(yīng)用案例^[4]，打響了病原體 mNGS 的第一槍。

新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志發(fā)表宏基因組二代測序（mNGS）確診鉤體病的文章截圖 | 圖源：NEJM

短短 5 年來，mNGS 在新發(fā)病原體鑒定、罕見重要病原體診斷和臨床大數(shù)據(jù)研究等方面取得諸多進(jìn)展。例如在 2018 年，Clinical and Research in Hepatology and Gastroenterology 發(fā)布了上海華山醫(yī)院感染科張文宏教授團(tuán)隊(duì)使用 mNGS 協(xié)助臨床診斷肝結(jié)核的案例，mNGS 的適時使用，準(zhǔn)確快速地幫助臨床明確了患者的發(fā)熱病因，推動了臨床的精準(zhǔn)診斷^[5]。

張文宏教授團(tuán)隊(duì)發(fā)表文章截圖 | 圖源：ScienceDirect

2019 年，中國臨床專家也達(dá)成共識，認(rèn)可了宏基因組分析和診斷技術(shù)在急危重癥感染領(lǐng)域的臨床應(yīng)用^[6]。

臨床專家共識文章截圖 | 圖源：萬方

宏基因組二代測序的流程及原理

宏基因組二代測序的檢測流程可以大致分為5個步驟：核酸提取、文庫構(gòu)建、上機(jī)測序、生物信息學(xué)分析與報告解讀[7]。

具體來看，對于不同的臨床樣本，核酸提取前需要進(jìn)行不同的前處理，比如痰液液化、破壁、去宿主等以提高病原體檢出率。RNA 病毒需要在文庫構(gòu)建前進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，生成 cDNA。文庫構(gòu)建的目的在于給未知序列的核酸片段兩端加上已知序列信息的接頭以便于測序，單樣本文庫構(gòu)建完成后需要經(jīng)歷 PCR 擴(kuò)增、再將多個文庫樣本混合后進(jìn)行測序。

測序完成后，數(shù)據(jù)會自動進(jìn)入搭建好的病原體自動分析流程，該流程包括去除人源宿主序列和低質(zhì)量序列、以及微生物數(shù)據(jù)庫比對注釋等步驟。最后，解讀專家根據(jù)自動化系統(tǒng)產(chǎn)生的初步結(jié)果，再結(jié)合部分臨床指標(biāo)、樣本類型、病原體種類等因素進(jìn)行綜合分析解讀。

宏基因組工作流程示意圖 | 圖源：Nature Biotechnology

樣本文庫質(zhì)量是宏基因組測序的關(guān)鍵

由于環(huán)境中的微生物種類五花八門，相對復(fù)雜，構(gòu)建一個高質(zhì)量的宏基因組文庫在整個檢測流程中便顯得十分重要。故而在取樣時，我們要嚴(yán)格遵循取樣規(guī)則，在取樣中應(yīng)盡量避免對樣本的干擾，縮短保存和運(yùn)輸?shù)臅r間，使樣品盡可能代表自然狀態(tài)下的微生物原貌。并且要采用合適的方法，既要盡可能地完全抽提出環(huán)境樣品中的 DNA/RNA，又要保持較大的片段以獲得完整的目的基因或基因簇。

在構(gòu)建 RNA 文庫之前需要對 RNA 樣本進(jìn)行完整性評估^[8]，只有達(dá)標(biāo)的樣本才能進(jìn)入下一階段反轉(zhuǎn)錄及文庫構(gòu)建。宏基因組文庫的質(zhì)量直接關(guān)系到測序的數(shù)據(jù)量，在影響成本的同時也影響了測序時間，因此，為了提高測序準(zhǔn)確性、減少測序過程中的風(fēng)險，測序前需要測定文庫樣品的濃度和片段大小分布，確定合適的上機(jī) pooling 方案和測序深度。可見樣本的質(zhì)量控制對于宏基因組測序的重要性。

安捷倫自動化樣本質(zhì)控解決方案

安捷倫在核酸蛋白質(zhì)量控制領(lǐng)域擁有愈二十年的經(jīng)驗(yàn)，針對不同來源樣本，分析靶標(biāo)和通量需求提供全套的自動化解決方案。安捷倫的 2100 生物分析儀是目前最為普遍使用的二代測序質(zhì)控設(shè)備。安捷倫在 2100 生物分析儀上最早開發(fā)出了 RNA 完整性參數(shù)（RIN），它已成為全世界公認(rèn)的 RNA 質(zhì)控指標(biāo)，它以 0-10 的數(shù)值直觀反應(yīng) RNA 樣本的完整性程度，為標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)操作提供了樣本質(zhì)量評估的參考標(biāo)準(zhǔn)。在本次新冠病毒（RNA 病毒）的序列確定中，安捷倫 2100 生物分析儀發(fā)揮了重要作用。

隨著測序樣本量的增加，特別是隨著后續(xù)病毒變異監(jiān)測以及病毒溯源工作的逐步展開，安捷倫中-高-超高通量自動化核酸質(zhì)控平臺（4200 tapestation 和 AATI FA）將發(fā)揮它們的優(yōu)勢。

參考文獻(xiàn)

[1] Yong-Zhen Zhang , Edward C. Holmes,Lin Xu,et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China[J].nature,2020.

[2] Xiao K, Zhai J, Feng Y, et al. Isolation and Characterization of 2019-nCoV-like Coronavirus from Malayan Pangolins[J]. bioRxiv, 2020.

[3] Handelsman J, Rondon M R, Brady S F, et al. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new frontier for natural products[J]. Chemistry & biology, 1998, 5(10): R245-R249.

[4] Wilson M R, Naccache S N, Samayoa E, et al. Actionable diagnosis of neuroleptospirosis by next-generation sequencing[J]. New England Journal of Medicine, 2014, 370(25): 2408-2417.

[5] Jing-Wen A , Yang L , Qi C , et al. Diagnosis of local hepatic tuberculosis through next-generation sequencing: Smarter, faster and better[J]. Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology, 2018, 42(3):178-181.

[6] 宏基因組分析和診斷技術(shù)在急危重癥感染應(yīng)用專家共識組. 宏基因組分析和診斷技術(shù)在急危重癥感染應(yīng)用的專家共識[J]. 中華急診醫(yī)學(xué)雜志, 2019, 28(2):151-155.

[7] Quince C, Walker A W, Simpson J T, et al. Shotgun metagenomics, from sampling to analysis[J]. Nature biotechnology, 2017, 35(9): 833.

[8] Fan W, Su Z, Bin Yu, et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China[J]. Nature. 2020 Feb 3. [Epub ahead of print]

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